Bis 1972 gab es nur 2 Nachweise der Zweifarbfledermaus in Thüringen. Mittlerweile verteilen sich die Sichtungen über das gesamte Bundesland. Da noch keine Wochenstuben entdeckt wurden, bleibt es ungewiss, ob die Art hier dauerhafte Populationen bildet. Generell ist sie über die gesamte nördliche Paläarktis verbreitet.

Im Sommer leben die Tiere in Spalten, Zwischendächern und Rollladenkästen. Sie sind großteils in Gebäuden anzutreffen und gelten deshalb als Kulturfolger. Sie besiedeln Quartiere aber überwiegend an den Außenwänden.

Die Jagd erfolgt im schnellen, gradlinigen Flug in 10 bis 40 m Höhe. Oft suchen sie ihre Nahrung in Insektenschwärmen über Gewässern. Sie bevorzugen freien Luftraum und jagen deshalb selten über Wald. Männchen haben mit Reichweiten bis 20,5 km ein größeres Jagdgebiet als die Weibchen.

Zum Überwintern wandert die Zweifarbfledermaus in wärmere Gebiete und sucht Quartiere an höheren Gebäuden wie Kirchtürmen. Fallen die Temperaturen stark ab, weichen sie auch ins Innere von Gebäuden aus.

Die Verteilung der Vorkommen in Europa ist sehr ungleichmäßig. In Dänemark sind sie häufig, aber im westlichen und südlichen Gebieten relativ wenig verbreitet und benötigen besonderen Schutz. Haussanierungen limitieren die Anzahlen der Quartiere. Windkraftanlagen und Straßen gefährden die Tiere bei ihrer Wanderung.