In Thüringen ist die Art mäßig häufig und in vielen Naturräumen nachgewiesen. Wochenstuben werden in wärmebegünstigten, strukturreichen Gebieten und fast ausschließlich in Gebäuden gefunden. Sie siedeln meist in Höhenlagen unter 500m NN. Das Große Mausohr überwintert auch in Thüringen und sucht dazu unterirdische Hohlräume wie natürliche Höhlen, Stollen oder Felsenkeller auf.

Die Sommerquartiere werden großteils in Dachräumen von Gebäuden bezogen. Typisch sind Vorkommen in Kirchen, deren Dachböden groß und ungestört sind. Die Weibchen bilden dabei große Cluster. Die Männchen nutzen Einzelquartiere im Wald (Baumhöhlen) oder an Gebäuden und Brücken.

Meist jagen die Tiere in einem Umkreis von 5 - 15 km, aber zwischen Jagdgebiet und Quartier können sie auch Strecken von bis zu 26 km zurücklegen. In dem genutzten Raum haben sie 1 - 5 Kernjagdgebiete. Sie jagen im niedrigen Flug,  1 - 2 m über dem Boden. Sie lauschen dabei nach Raschelgeräuschen im Laub und greifen die Beutetiere (Laufkäfer) vom Boden auf.

Das Große Mausohr besiedelt unterirdische Quartiere, wie  Stollen, Höhlen, Bunkeranlagen und Felsenkeller. Sie suchen Bereiche auf, die mäßig feucht und mit bis zu 12° C relativ warm sind Dabei können sie Cluster von mehreren Tieren bilden. Zwischen Winterquartieren und Sommerquartieren liegen Distanzen von 50 - 100 km.

Der Gesamtbestand an adulten Großen Mausohren in Thüringen wird auf mehr als 36.000 Tiere geschätzt . Aktuell sind ca. 60 Wochenstubenvorkommen in Thüringen bekannt. Jedes Weibchen bringt nur ein Jungtier pro Jahr zu Welt. Nutzungskonflikte und unkoordinierte Sanierungen der Dachräume z. B. im Sommerhalbjahr gefährden jedoch die Wochenstubenvorkommen bzw. die ungestörte Aufzucht der Jungen.